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原位杂交实验及其注意事项

原位杂交

原位杂交(in situ hybridization)是应用已知碱基顺序并带有标记的核酸探针与组织、细胞等样本中待测目的基因按碱基配对原则进行特异性结合而形成的杂交体,然后再用与标记物相应的检测方法,在被检测的核酸原位形成带颜色的杂交信号,从而在显微镜下进行目的基因的定位检测观察。主要检测方法分为DAB显色和荧光显色两种

注意事项

1固定液的选择及固定时间  石蜡组织建议用10%中性缓冲福尔马林固定648h,其它固定液对实验结果可能产生一定的影响。  组织离体后应尽快固定,建议在标本离体后30min内固定。如样本固定不及时,荧光信号会减弱。  固定液的体积是组织体积的420倍,否则固定不充分,容易出现无信号或者信号很弱的现象。  而且,为了保证信号的准确性,蜡块最好在2年内进行检测,已经切好的切片在6周内检测最佳。

2、组织切片和载玻片的选择  组织切片45μm 厚,过厚或过薄的切片均会对信号的强弱产生影响,而且切片应完整,质量良好,否则会在预处理时掉片。  载玻片的选择建议使用防脱载玻片,有条件的实验室可使用更好的阳离子或者阴离子专用载玻片,可有效防止脱片现象的发生。  

3、实验过程中切片的预处理  切片预处理过程包括煮沸处理和蛋白酶消化。当组织处理不规范、切片过厚或烤片不足时,在煮沸过程中容易掉片,建议烤片温度在56℃过夜。  煮沸过程中要严格控制实验温度和时间。酶消化是 FISH 实验的关键步骤之一,如果对组织不熟悉,可以先消化推荐的反应时间,然后复染 DAPI在荧光显微镜下观察,在DAPI通道下,以细胞既无空洞(消化过度),亦无明显的云雾状(消化不足)为最佳,同时可切换观察红绿通道,以红绿通道无明显的背景为佳,如果背景较高,可适当延长消化时间。  另外,对于陈旧的石蜡组织切片,要适当延长消化时间,否则会出现大量的自发荧光。若消化不足所致 FISH 信号减弱或丢失(1),消化良好时FISH信号较好(2)    

4、变性和杂交  变性和杂交是本实验最关键的步骤,变性的时间和温度是杂交成功是否的关键,为保证变性期间温度的稳定,建议采用专业的原位杂交仪进行变性和杂交步骤,不仅能够减少实验的繁琐性,而且更有利于实验条件的控制,比如时间、温度和避光条件等。为避免杂交液在变性和杂交过程中的损失和防止干片,一定要在盖玻片的四周用橡胶水泥进行密封。  

5、杂交后洗涤温度、时间和封片保存  杂交后的洗涤对于整个实验结果的影响非常重要,首先应保证正确配置杂交洗涤液,洗涤液温度偏高或时间过长,可导致信号减弱,洗涤液温度偏低或者时间过短,会产生杂信号过多、红绿信号对比性差或者特异性低等情况。  在复染完 DAPI 以后,加盖盖玻片,用指甲油固定住盖玻片四角,这样可以防止在油镜下观察时盖玻片脱落。由于荧光信号容易淬灭,所以在染色后应立即观察,如果当时不能观察,可将切片放入切片盒中,保存于-20℃冰箱里2周以内。  

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