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流式细胞凋亡检测

Annexin V/PI 流式检测细胞凋亡

在正常细胞中,磷脂酰丝氨酸(PS)只分布在细胞膜内侧,但在细胞凋亡早期,磷脂酰丝氨酸(PS)会由细胞膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种分子量为35~36kDCa2+依赖性磷脂结合蛋白,与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力,故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的包膜结合。因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V进行荧光素(FITC)标记,以标记了的Annexin V作为荧光探针,利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞早期凋亡的发生。碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但对凋亡中晚期的细胞和死细胞,PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin VPI结合使用,就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

流程

1. 细胞收集:悬浮细胞直接收集到10ml的离心管中,每样本细胞数为(1~5×106/mL500~1000r/min离心5min,弃去培养液。

2. 用孵育缓冲液洗涤1次,500~1000r/min离心5min

3. 100ul的标记溶液重悬细胞,室温下避光孵育10~15min

4.500~1000r/min离心5min沉淀细胞孵育缓冲液洗1次。

5. 加入荧光(SA-FLOUS)溶液4℃下孵育20min,避光并不时振动。

6. 流式细胞仪分析:流式细胞仪激发光波长用488nm,用一波长为515nm的通带滤器检测FITC荧光,另一波长大于560nm的滤器检测PI

7. 结果判断:凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI有抗染性,坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞的DNA可被PI着染产生红色荧光,而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此,在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在双变量流式细胞仪的散点图上,左下象限显示活细胞,为(FITC-/PI-);右上象限是非活细胞,即坏死细胞,为(FITC+/PI+);而右下象限为凋亡细胞,显现(FITC+/PI-)。

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